抗体标记和探测

Amersham WB 系统

设计为每次实验的每个样品提供一致的、可定量的Western印迹数据。

一旦已完成样品分离并转移到NC或PVDF印迹膜上,就要使用特异性抗体来检测目的蛋白。

Western印迹方案经常使用非标记的一抗来直接检测目的蛋白。采用种属特异的标记二抗来结合一抗,测量标签发出的信号,其信号强度代表膜上目的蛋白的含量。

为了防止抗体的非特异性结合,探测前通常将印迹膜在封闭液中进行孵育。

Western免疫印迹通常利用疏水性相互作用在印迹膜固定生物分子,印迹膜通常由化学惰性材料(如PVDF或NC膜)制成,当非特异性抗体结合到印迹膜上,膜表面未被占用区域不利于特异性分析和高灵敏度检测,所以“封闭”膜很有必要。

封闭剂(通常是蛋白或非离子型去垢剂)的选择要根据采用的检测系统或检验原则作为指导。例如,牛血清白蛋白(BSA)是常用的封闭试剂。

一抗的选择取决于目的蛋白是如何折叠的,因为在不同的条件下暴露出的抗原表位不同。虽然内部抗原表位通常被蛋白隐藏起来,但是当探测变性蛋白时就有利于针对内部抗原表位的抗体。

GE医疗提供规格齐全的Amersham高质量二抗产品,需根据一抗物种类型进行选择,标记方法选择取决于检测参数,例如所需的灵敏度水平。四种常用的标记系统为:酶,荧光基团,生物素化,放射性同位素。

生物素化

链霉亲和素对生物素有异常高的亲和力,生物素/链霉亲和素相互作用对于包括Western印迹在内多种的技术非常有用。通常,生物素化的二抗与链霉亲和素-HRP一同使用,产生的信号强度可以检测低丰度的目标蛋白。

碱性磷酸酶(AP)和辣根过氧化物酶(HRP)是Western印迹中蛋白检测最常用的两种酶。两种酶都可用于化学发光、化学荧光或者显色底物。

碱性磷酸酶辣根过氧化物酶
大小(分子量)140 00040 000
价格
稳定性0℃以下不稳定0℃以下稳定
底物数量
动力学
最佳的pH范围8-105-7

荧光检测

得益于数码成像技术的高灵敏度,在Western印迹系统中使用荧光基团更加普遍。荧光检测的优势包括高灵敏度,很宽的线性动态范围,信号随时间变化稳定。

荧光适于定量的Western印迹。另外,使用多种荧光基团发出不同特征波长的光,可以同时在一个印迹中检测几种不同的蛋白(多通道检测)。

放射性同位素检测

35S和125I是标记抗体最常用的放射性同位素,需要特别注意的是:基于放射性的检测需要处理放射性废物并采用专门的通风柜,尤其是使用125I时。放射性同位素具有高灵敏性,但是需要相对长的曝光时间,可使用磷屏缩短曝光时间。

GE是电泳技术的创始人,源自1937年的LKB。SDS-PAGE电泳设备的选择通常基于目标蛋白性质、所需分辨率、缓冲液体积、操作效率等等。不论你倾向于预制胶或者手动制胶,垂直或者水平电泳系统,GE医疗生命科学提供经典的Amersham电泳系统在可靠性和方便性上得到行业用户的高度认可。

我们的垂直系统包括:miniVE,SE250和SE260迷你型垂直电泳槽,以及SE2600 Ruby,SE600 Dual Cooled,和SE400垂直电泳槽。

除了垂直系统,我们提供了水平平板系统包括Amersham Multiphor II,和PhastSystem。

Amersham 水平凝胶电泳系统降低缓冲液耗费,消除缓冲液从顶部溢出到底部缓冲室的风险,热量均匀分布于整块胶表面,减少“笑脸”胶产生的风险。

分子量标准Marker提供了一个对数的比例,通过它来估计样品中未知蛋白大小。对于大多数电泳,建议至少保留一个泳道作为分子量Marker上样道。PAGE电泳之前,Marker和带分离的样品需暴露在同样的条件下。

除了估算大小,分子量标准Marker可以监控整个电泳过程中蛋白的进度,以及评估转膜效率。GE医疗的预染和未染色的分子量标准Marker使您可以估算由PAGE分离的蛋白分子量,分子量范围从2500到669000(2.5kDa到669kDa)。

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