应用实例

为了对Western Blotting中的蛋白进行精确定量,必须对不同泳道间的总蛋白上样量差异进行归一化。

这通常是通过定量 “管家”蛋白的水平来实现的,这种定量方法首先洗脱掉膜上用于检测靶蛋白的抗体,再用另一种不同的针对管家蛋白的抗体重新检测,最后进行归一化分析来实现。但是,洗脱过程中可能出现印迹膜表面上蛋白发生不均匀丢失的风险。使用基于荧光的Amersham ECL Plex试剂,可实现多通道检测,无需洗脱和再杂交步骤。


在Western Blotting中进行多通道检测

用成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)处理的野生型和基因敲除型成纤维细胞裂解物研究细胞内信号分子ERK1/2的激活。这些裂解物通过SDS-PAGE进行分离,在进行转印后,用小鼠抗ERK1/2和兔抗GAPDH一抗孵育,随后使用Amersham ECL Plex抗小鼠Cy5(发射红光)和Amersham ECL Plex抗兔Cy3(发射绿光)同时检测膜上两种蛋白的信号

通过在同一个印迹上检测两种蛋白,蛋白表达能够相对于一种管家蛋白比如甘油醛--磷酸脱氢酶(GAPDH)进行定量。感谢瑞典乌普萨拉大学医学生物化学和微生物学系的Jin-Ping Li博士和Juan Jia博士提供的数据。

尽管蛋白定量分析表明每个泳道中加入相似数量的总蛋白,但是因管家蛋白GAPDH的检测所发出信号的强度明显显示情况不是这样的。如果不相对于GAPDH水平,不能看到明显的与野生型和敲除型细胞相关的ERK1/2激活。但是,当将其与GAPDH信号进行归一化后,在暴露于FGF-2的敲除型细胞中,ERK1/2水平显示有所增加。

灵敏地检测低丰度蛋白

当使用基于凝胶电泳和/或基于印迹的定量分析技术时,如何实现低丰度蛋白定量检测尤为重要,低丰度蛋白定量检测需要高灵敏度和宽线性动态范围。一个宽的线性动态范围对那些在同一个实验系列中同时比较强信号和弱信号的应用尤其重要。例如,一个对转铁蛋白进行两倍稀释的系列,采用Amersham ECL Prime试剂,并利用基于CCD相机的Amersham Imager 600分析。该分析既具有高灵敏度,也可对覆盖几个数量级的线性动态范围进行定量。

使用Amersham ECL Prime对广泛的动态范围进行灵敏度检测以检测Western印迹上的转铁蛋白。

化学荧光指的是化合物和/或酶产生的荧光。在酶和底物之间的催化反应导致在反应位点形成一种荧光产物,同时导致一个放大的信号。

比色法

使用染料比如考马斯蓝和银染的比色法被广泛应用于显现和检测蛋白质。银能够用于检测低至亚纳克量的蛋白质。

放射性同位素检测

尽管已经出现了替代基于放射性同位素的系统,但放射性同位素比如32P, 33P, 35S, 14C, 3H 和125I仍在一些领域提供了一些优势。因其灵敏性而快速,放射性系统与磷光屏的结合仍然被用于Soutern和Northern印迹。

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