层析聚焦(CF)

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层析聚焦根据等电点(pI)的不同来分离蛋白。当pH等于pI时,蛋白的表面静电荷为零。它是一种有利的高分辨率分析性的分离方法。层析聚焦技术的分辨率非常高,可以达到0.02个pH单位,因此它可以分离性质非常相近的蛋白。但是,这种方法的容量非常小,因此多用于分离已经部分纯化后的样品。

随着缓冲液和层析介质的相互作用,层析柱中产生一个pH梯度。CF的填料是一种弱阴离子交换剂,缓冲液中含有大量的缓冲物质,如Polybuffer。不同蛋白的等电点不同,在柱上的迁移速率不同。随着pH梯度的降低,蛋白与填料之间不断地结合和解离,最终聚焦成一条很窄的条带,最终被洗脱。缓冲液由许多的缓冲物质比如Polybuffer组成。带有不同等电点的蛋白质以不同的速度向填充柱底部迁移,随着pH梯度的降低,不断地结合和解离并聚焦成很窄的带,最终被洗脱。

等电点高的蛋白先洗脱,等电点低的蛋白后洗脱。梯度的上限由起始缓冲液的pH决定,而梯度的下限则由洗脱缓冲液的pH决定。Polybuffer可以形成3个pH单位或更小的pH梯度范围,pH范围越窄,分辨率越高。

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