电泳

Amersham WB 系统

设计为每次实验的每个样品提供一致的、可定量的Western印迹数据。


电泳通常基于大小或者电荷来分离蛋白。通常,包含目的蛋白的样品被加到多孔的基质中然后施加电压。样品中的蛋白质会在基质中基于各自不同的大小和电荷以不同的速率迁移。

分离结束时,蛋白质以位于基质中不同垂直位置的条带的形式进行检测。基质可以由不同的材料组成,包括纸,醋酸纤维素,或者聚丙烯酰胺凝胶,琼脂糖凝胶或者淀粉凝胶。

聚丙烯酰胺凝胶是在被称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的过程中分离蛋白质最常用的基质。

由于蛋白的净电荷影响其在电场中的迁移,因此通常添加去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)来使蛋白样品和缓冲液变性。大约按多肽长度比例将负电荷附加到蛋白上,确保蛋白的迁移率主要取决于分子量大小而不是带电量。

在不加入SDS情况下进行天然(非变性)凝胶电泳,蛋白的迁移率取决于它所带的电荷和分子大小。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率取决于蛋白大小和凝胶孔隙度。因此需要试验几种丙烯酰胺的浓度来优化迁移条件。聚丙烯酰胺凝胶可以被灌制为同质和梯度胶。

同质胶整块胶具有均一的聚丙烯酰胺浓度,而梯度胶为了有更广的分离范围其包含线性增长的丙烯酰胺浓度,但具有低的分辨率。丙烯酰胺(%T)和交联度影响了胶的浓度:%T越高,孔径越小,越多的蛋白在迁移中受阻。

传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳设备使用了两种胶,浓缩胶置于分离胶之上。浓缩胶是均质的,含有相对大的孔径(%T 4%到5%)。电泳过程中,蛋白进入分离胶之前在这一相中被浓缩称狭窄的条带,因此增加了条带的分辨率。分离胶中的%T范围可以从5%到20%。

目标大小范围(Mr)分离胶中的%T
36 000-205 0005%
24 000-205 0007.5%
14 000-205 00010%
14 000-66 00012.5%
14 000-45 00015%

GE医疗提供试剂和配件用于凝胶灌制,以及一系列预灌聚丙烯酰胺凝胶例如ExcelGelPhastGelDALT Gel

蛋白质的特征由带电量影响,而带电量则由周围介质的pH以及它们的羧基和氨基的电离状态决定。翻译后修饰也会影响整个蛋白的带电量。因此介质的pH值必须在电泳时保持稳定。

通常使用两种缓冲液系统:连续缓冲系统与不连续缓冲系统。连续缓冲液系统的电极槽中和凝胶使用了同一种缓冲液。不连续缓冲系统中,两个胶层使用了不同的缓冲液,电极槽缓冲液也与凝胶缓冲液不同。连续缓冲系统设置稍微更简单,而且引起更少的样品沉淀和聚集的难题。然而不连续缓冲系统提供了较高的蛋白分辨率,具有更广泛的应用。

许多设备可用于运行聚丙烯酰胺凝胶,设备的选择通常是基于目标蛋白的性质,所需的分辨率,以及个人喜好。不论你倾向于预制胶或者手制胶,垂直或者水平电泳系统,我们都有一系列的设备使您方便和可重复的进行电泳。

我们的垂直系统包括:miniVE,SE250和SE260迷你型垂直电泳槽,以及SE600 Ruby,SE600 Dual Cooled,和SE400垂直电泳槽。

除了垂直系统,我们提供了水平平板系统包括Multiphor II。

使用预制胶的水平Amersham ECL凝胶电泳系统提供优于垂直系统的很多优势,例如降低缓冲液耗费,消除缓冲液从顶部溢出到底部缓冲室的风险。另外,电泳产生的热量均匀分布于整块胶表面,减少“笑脸”胶产生的风险。

分子量标记物由大小和PAGE运行时间过程中迁移距离已知的蛋白混合物组成,提供了一个对数的比例,通过它来估计样品中未知蛋白质的大小。对于大多数电泳,建议至少保留一个泳道作为分子量标记物上样道。聚丙烯酰胺凝胶电泳之前,标记物和样品需要暴露在同样的条件下。

除了估算大小,分子量标记物使你可以监控整个电泳过程中你的蛋白的进度,以及评估转膜效率。GE医疗的预染和未染色的分子量标记物使您可以估算由PAGE分离的蛋白分子量,分子量范围从2500到669 000(2.5kDa到669kDa)。

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