疏水作用层析(HIC)

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疏水层析的分离是基于蛋白质的疏水性氨基酸与基质的疏水性配基之间的可逆性相互作用。

蛋白质和多肽的疏水氨基酸大多埋藏在蛋白质分子结构的内部。然而,仍然有一些疏水性氨基酸会暴露在蛋白分子的表面与基质的疏水性配基进行相互作用。与反相层析相比,疏水作用层析基质上的配体浓度要低很多,洗脱条件也更加温和,从而有助于保持生物分子的生物活性。HIC特别适合于纯化经过硫酸铵沉淀或高盐洗脱后的样品,高离子强度可以加强蛋白与填料配基之间的疏水相互作用。

高离子强度的缓冲液可以增强疏水相互作用,这使得HIC成为硫酸铵沉淀和离子交换层析的一个卓越的纯化步骤。HIC非常适合于纯化工艺中的捕获或中纯步骤。

HIC期间,样品成分在高离子强度的缓冲液(典型的是1~2M的硫酸铵或者是3M的NaCl)中结合到填充柱上。高浓度的盐,尤其是硫酸铵,可能会沉淀蛋白质。因此,需要检测将要使用的结合条件下靶蛋白的溶解性。通常采用降低的盐梯度对靶蛋白进行连续梯度或分布梯度洗脱。

根据蛋白质结构,处于水溶液中的蛋白质会不同程度的暴露在分子表面。这些暴露的残基既有亲水性的氨基酸(比如带电荷的氨基酸),或者疏水性氨基酸(如苯丙酰胺、酪氨酸、色氨酸)。一般而言,疏水基团更喜欢埋藏在蛋白质三维结构的内部,但是有些基团会暴露。高浓度的盐可以使蛋白质-蛋白质之间进行结合而从溶液中析出或形成结晶。从Hofmeister开始,科学家们已经认识到不同类型的盐在蛋白质分子间的相互结合或疏水表面之间的相互作用过程中起到了重要的作用。

这些现象形成疏水作用层析(HIC)的基础。根据蛋白质结构和一系列可控因素包括盐浓度、pH、温度和有机溶剂,含有疏水基团的层析基质以不同程度结合水溶液中的蛋白质,如下图所示。

HIC适合纯化过程的所有步骤。应用实例包括高产量捕获、单克隆抗体精细纯化、分离全长形式的蛋白和截短体、活性物质和无活性物质的分离以及病毒清除。

从HIC层析柱上对四种具有不同3D结构的模型蛋白质进行洗脱的图解,利用一个递减的盐浓度梯度。黄色表示疏水残基。

最好的工作流程取决于应用;首先,确定纯化是否将在工业生产过程中被放大。

对于许多研究中的应用,填料选择简单地由所需要的纯度决定。成功的填料选择重点在于找到具有良好产物回收率的最佳选择性的填料,而对方法优化和表征的需要通常将小于对于将被放大并用于常规工业生产的需要。对于两种类型的应用,工作流程以相同的方法开始,如下图所示。

HIC层析介质的选择及实验结合/洗脱条件的筛选流程。

GE医疗在1977年引入了第一种市售的HIC介质,并提供市场上最广泛的HIC介质,涵盖了绝大多数常规实验室和工业应用。除了一系列的HIC产品,疏水相互作用经常在多模式层析介质起着作用。这些介质经常被描述成耐盐的离子交换剂,或者是提供特殊选择性的离子交换剂。GE 医疗提供这一类多模式交换剂包括Capto MMC和Capto adhere。

我们的BioProcess介质家族支持生物制药的大规模生产。这种支持包括验证生产方法、稳定而长期的介质供应、安全并易于处理以及帮助工艺验证和提交给监管机构的法规支持文件(RSF)。另外,Fast Trak还为所有的生物工艺开发和生产厂用户提供高水平、亲自动手操作的培训教育课程。

从捕获到精细纯化

在一系列的应用中为了实现HIC高分辨率分离,这需要一系列具有不同疏水性和可操作特性的介质。这是通过改变基质和配体的化学性能来实现的。尤其对于工业下游工艺,根据应用可能需要不同粒径大小的填料,尤其是用于捕获或精细纯化。

填料粒径大小的选择要考虑到纯化的分辨率要求以及操作的压力限制(主要受样品粘度和设备的规格所限制)。因此,为了能够覆盖更多的应用,我们提供了一系列大粒径的层析介质,比如Octyl Sepharose 4 Fast Flow 和 Butyl Sepharose 4 Fast Flow。该图展示的是基于100个实验得到的结果,在这些实验中,不同大小、疏水性和电荷的六种模型蛋白用同样的硫酸铵梯度进行洗脱。

HIC介质的疏水性示意图。基于六种模型蛋白的洗脱研究:卵白蛋白、a- 胰凝乳蛋白酶原、核糖核酸酶、乳铁蛋白、溶菌酶a-淀粉酶。

选择合适的介质

根据不同纯化阶段的目的及挑战的不同,蛋白质的纯化可以分为捕获、中度纯化、精细纯化三个阶段。HIC可以应用于任何阶段。Capto介质提供了一系列广泛的操作条件。根据介质筛选的结果选择最合适的层析介质。

  1. 通常,使用75μm的capto系列层析介质用于捕获和中度纯化阶段,以获得高产率。
  2. 当Capto介质不能达到所需要的结合选择性时,可以选择90μm的Sepharose Fast Flow介质,它可以以300cm/h的流速快速捕获蛋白。
  3. 最后,对分辨率要求比较高的精细纯化阶段可以选择34μm的Sepharose High Performance进行高分辨率纯化。

 

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