核酸印迹

核酸电泳免疫印迹(Southern Blotting 和Northern Blotting)是研究DNA/RNA图谱的基本技术,广泛用于遗传病诊断、图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变、片段长度多态性分析(RFLP)等方面,是一项广泛被业界认可的技术。

40年前,创始人E.M.Southern最早采用Whatman硝酸纤维素膜作为DNA转印支撑物,自此GE 医疗生命科学Whatman和Amersham品牌的印迹、标记、检测产品被在全球广泛使用,可靠品质成为业界典范。

Southern印迹用于检测DNA混合物中的一段序列,Northern印迹用于检测RNA混合物中的一段序列。Southern和Northern印迹是最常用的两种核酸印迹技术。

  • Southern印迹可用于定位基因,应用包括检测大基因重排/缺失以及大的三核苷酸的重复扩增
  • Northern印迹用于测定基因表达,比如涉及分化、形态发生和遗传研究。
  • 用于核酸印迹的操作步骤由五步组成:核酸电泳、核酸印迹、探针标记、杂交检测及图像分析

    印迹技术(Blotting)涉及在凝胶中对核酸进行电泳分离、将分离的成分转移到印迹膜上、通过探针检测膜上特异性序列。由于探针不容易进入到凝胶中,因此将核酸转移并固定到膜上使探针检测成为可能。

    其他核酸印迹方法不含电泳,比如斑点印迹、狭缝印迹和克隆或噬菌斑原位杂交。斑点印迹和槽印迹为直接将样品上样到膜上,然后再用探针检测。克隆和噬菌斑原位杂交为直接将培养板上的微生物克隆转移到膜上,这些微生物在原位被裂解并用探针来检测。当检测较简单,受干扰分子影响小,或者只需要一个初始分离步骤时,这些技术可以快速地给出充分的信息。

      此外,同样普遍采用的PCR技术(聚合酶链式反应)虽然已在某些应用中取代了印迹,比如在复杂混合物中对核酸序列进行检测或定量。尽管如此,Southern印迹仍然有它的优势,比如从大片段中确定序列的位置,检测染色体的重排,从较低同源性的序列中挑出相关基因,以及确定基因拷贝的数量等。

      相比PCR技术,Northern印迹的灵敏度较低,但特异性较高,因此避免了PCR技术的假阳性风险。Northern印迹也使检测新剪接变体成为可能,而基于PCR的剪接事件的研究可能需要对可能的剪接位点有先验知识。

    印迹(Blotting)通常由许多步骤组成,为了确保实验的成功和再现性,实验者必须注意每一步的实验细节和使用的系统及耗品。

    在Southern印迹中,对序列的准确定位需要对全基因组DNA的高质量制备,或者是利用高效的限制性酶对片段进行精确控制。分离、转移和检测都涉及方法的优化,任何样品前处理都会对片段长度及纯度产生影响。

    定量分析需要一块凝胶的所有泳道负载相同数量的总蛋白,常运用光谱法测定溶液的蛋白浓度,但是都不是特别方便。2-D Quant Kit

    Filter characteristics and typical properties

    The selection of a laboratory filter depends on the conditions and objectives of your experiment or analytical procedure. The three most important characteristics of any laboratory filter are:

    • Particle retention efficiency
    • Fluid flow rate through the filter
    • Loading capacity

    According to your particular application, other important filter characteristics may also require examination, for example wet strength, chemical resistance, purity, and ash level. 

    Typical properties of filter papers and glass fiber filters

    Membrane materials

    Chemical compatibility chart of membranes and housings


    Filtration Methods for flat filters

      Gravity Vacuum Pressure
    Cellulose Filter Papers Suitable Suitable Not generally used
    Glass Microfiber Not suitable Suitable Suitable
    Membranes Not suitable Suitable Suitable


    Maximum practical volumes of cellulose filter paper circle sizes (quadrant folded)

    Volume (ml) 15 20 35 75 135 300
    Filter Diameter (mm) 90 110 125 150 185 240

     

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