蛋白纯化策略

纯化策略通过在不同规模上提供快速和简易性的解决方案革命性的改变了纯化。

开始纯化前,明确您的要求和目标非常重要。这些可能包括明确所需的纯度、活性和产物的量,使处理和操作步骤最小化,去除关键的杂质(比如蛋白酶)。不管蛋白纯化的规模是用于研究的微克和毫克数量级,还是用于工业领域的千克到吨数量级,我们有已经被证明的策略帮助您应用一种系统的方法进行纯化。

CIPP纯化策略。捕获阶段减少不需要蛋白的数量并浓缩目的蛋白。中间纯化去除大多数与目的蛋白相关的杂质。精细纯化去除特定的杂质和在分离和纯化的过程中形成的不想要的目的蛋白状态。

CIPP整体的纯化能力依赖于几种选择性独立的技术的结合。这些技术一起提供了目的产物一种稳定并节约成本的生产方法。当计划一个CIPP策略时,考虑纯化工艺的规模和目的产物需要的产量和应用非常重要。

在多步骤纯化策略中,每个纯化步骤必须有一个清楚指定的目的。增加纯化步骤经常会降低总蛋白的回收率,延长纯化时间、影响目的蛋白活性。对于绝大多数实验室规模的工作,两步或三步的纯化方案一般就足够了,而困难的纯化可能需要一些额外的步骤。

    组氨酸标签蛋白纯化

    由于组氨酸标签很小并几乎不会干扰靶蛋白的功能、活性或结构,因此被广泛使用。固定化金属离子亲合层析(IMAC)是纯化组氨酸标签蛋白最常用的方法。选择性地负载共价金属离子(比如镍或钴)的IMAC层析介质能够截留组氨酸标签蛋白,并在应用变性条件时,能从包涵体中纯化出不溶性的组氨酸标签蛋白。成功的IMAC纯化能得到高纯度的产率和高活性的靶蛋白。

    因为很多蛋白质有内在的组氨酸和/或半胱氨酸氨基酸残基,其他非特异的蛋白能够与靶蛋白一起结合到IMAC填充介质上。这种情况下,需要经常通过改变溶液中咪唑的浓度来优化结合、洗涤和洗脱的条件。增加结合和洗涤缓冲液中咪唑的浓度通常会降低非特异性结合,而更低的浓度则导致更强的亲和相互作用。找到正确的平衡非常关键。

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    Strep-tag™ II标签蛋白纯化

    Strep-tag™ II是一个只有8个氨基酸的小标签,它的相对分子量只有1000。它的小尺寸非常有好处,因为在绝大多数情况下它不会干扰结构和功能研究,因此无需去除。

    Strep-tag™ II特异性地结合拥有固定在琼脂糖基底基质的StrepTactin™配体的StrepTactin™ Sepharose High Performance以获得到纯净的靶蛋白。Strep-tag™ II与固定配体的结合亲和力是链霉亲和素的近100倍,使其适合于纯化Strep-tag™ II蛋白。在生理条件下进行纯化,含有脱硫生物素的温和洗脱液保留了靶蛋白的活性。

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    MBP-标签蛋白纯化

    麦芽糖结合蛋白(MBP)是一种有用的亲和标签,它们能增加生成靶蛋白的表达水平和溶解性。MBP标签也促进依附蛋白合适的折叠。因为MBP能增加溶解性,这个标签对以不溶形式(包涵体)聚集的重组蛋白特别有用。

    亲和纯化在生理条件下发生,并且使用麦芽糖进行温和地洗脱。温和的洗脱能保留住MBP标签蛋白的活性。

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    GST-标签蛋白纯化

    谷胱甘肽s-转移酶(GST) 基因融合系统是用于从大肠杆菌中生产的GST-标签蛋白的表达、纯化和检测的通用系统。可在非常温和的条件下对GST-标签蛋白进行纯化,从而保留靶蛋白的功能和抗原性。

    GST标签可能增加靶蛋白的溶解性和稳定性。GST标签很大,其相对分子量(Mr)为26000。一段特殊的切割序列允许在纯化后用不同的蛋白酶简单地去除GST标签。

    GST-标签蛋白的典型特点包括与谷胱甘肽琼脂糖层析介质上的谷胱甘肽配体高特异性的结合,一个步骤就能使洗脱的靶分子的纯度超过90%

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    不带标签或天然蛋白的纯化

    不带标签重组或天然蛋白经常需要一个多步纯化步骤以获得足够的纯度。这些蛋白可能来源于天然原料或者不带标签的过表达,因为标签的存在会干扰蛋白的应用。

    纯化策略-捕获、中间纯化和精细纯化(CIPP)-是一种简化蛋白纯化计划和执行的工具。这个策略给出的指南用于如何以最好的方式结合纯化方法从而达到设定的目标。

    在蛋白纯化策略页面了解更多关于CIPP的信息。

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