蛋白转移

Amersham WB 系统

设计为每次实验的每个样品提供一致的、可定量的Western印迹数据。


通过PAGE将蛋白质分离之后,下一步就是将蛋白从凝胶上转移到一般由化学惰性基质制成的固体支撑膜上,如硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯(PVDF)。

电转是转膜最常用的方法。常用的有两种-湿转和半干转。GE医疗提供了槽式印迹仪器用于高效的湿转和半干转。

湿转过程中,凝胶和膜全部浸入转膜液。当蛋白分子量较大,或者想得到最佳转膜效率时推荐使用湿转。我们的湿转仪器包括:miniVE,TE22,TE62。

对于半干转膜,使用在转膜液中浸湿的几层滤纸将凝胶和膜夹成三明治结构。三明治位于电极板之间,当施加电压时便构成了正极和负极。半干转比湿转速度快而且耗费更少的缓冲液。我们的半干转仪器包括:TE70,TE77,以及带NovaBlot配件盒的Multiphor II。

转印缓冲液提供了转印装置电极间导电的连续性。另外,缓冲液提供了维持蛋白可溶性的化学环境,而没有干扰其结合膜的能力。

Towbin缓冲液是湿转最常用的缓冲液,包含Tris和甘氨酸。缓冲液pH值是8.3,比大多数蛋白的等电点(pl)都高,这保证了带负电荷的蛋白质(被SDS包被)向正极迁移。

膜自身的化学特性以及孔径大小很大地影响了分子结合到膜上的程度,孔直径大小范围从0.05到10μm。具有许多小孔径的膜比具有大孔径的膜有更大的结合表面,因此具有更高的结合能力。

需要注意的是虽然蛋白构象和缓冲液成分也会影响结合能力,但实验的整体灵敏度取决于提呈给一抗的固定的蛋白质的数量。硝酸纤维素膜和PVDF膜是Western印迹最常用的膜,有时也会用到尼龙膜。

表1. Western印迹中使用的膜的一些重要特征

作用方式 最佳固定化条件 染色选择 优点 缺点
硝酸纤维素膜 非共价键或疏水性 高盐/低甲醇 氨基黑 多种用途 易碎,除非由聚酯支撑网的支撑
      苯胺蓝黑 低背景  
      丽春红S    
      胶体金    
      固绿    
PVDF 偶极子和疏水相互作用 在水溶液中使用前在甲醇中浸湿 氨基黑 高蛋白结合能力  
      机械强度  
      印度墨水 化学稳定性  
      考马斯亮蓝    
      胶体金    
      丽春红S    

表2. 使用不同检测试剂时膜材料的适用性

硝酸纤维素膜 PVDF膜
  Amersham
Protran Premium
Amersham Protran Amersham Protran Supported Amersham
Hybond LFP1
Amersham Hybond Amersham
Hybond SEQ
Amersham ECL +++ ++ + +++ ++
Amersham ECL Prime ++/+++ ++ Nt +++ ++
Amersham ECL Plex +++ ++ +++ - -
ECF + - Nt +++ -
比色试剂 +++ ++ Nt ++ ++
放射性试剂 + ++ Nt ++ ++

+=适合,++=推荐,+++=高度推荐,-=不推荐,nt=未测试。1Amersham Hybond LFP PVDF开发用于荧光反应,还未进行其他检测试剂的验证。

有多种方法可以让你检测是否所有的蛋白都从胶上转移到了膜上。全蛋白染色可以用于染胶或者转印膜。

使用可见的预染分子量标记物例如Rainbow Markers 或者DualVue Markers是一种简单方便的方式来估算胶上所有分子量蛋白的转移,因为大分子量和小分子量蛋白在同一种电泳条件下迁移的速率不同。

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